近年來，隨著石墨烯研究熱潮的興起，將石墨烯用于生物及化學檢測的工作也日益增多。本文著重介紹了基于石墨烯及氧化石墨烯(GO)的光學生物傳感器，特別是基于石墨烯的熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)傳感器以及比色法傳感器的設(shè)計思想和傳感特性。

　　1、引言

　　石墨烯是一種由純碳原子的六元環(huán)平面結(jié)構(gòu)構(gòu)成的二維材料，是零維的富勒烯、一維的碳納米管(CNTs)以及三維石墨結(jié)構(gòu)的構(gòu)筑基元。它具有非常大的理論比表面積、很高的楊氏模量、超高的光學透過率、優(yōu)良的導熱性和導電性，并能夠通過電子轉(zhuǎn)移實現(xiàn)熒光猝滅。目前，人們已將基于石墨烯的材料廣泛應用于諸多領(lǐng)域，如吸附劑、催化劑、藥物載體等。石墨烯具有的奇特性質(zhì)，使得其能夠滿足高靈敏性傳感器設(shè)計的需求，并已用于構(gòu)建光學、電化學及場效應傳感器、細胞標記及實時監(jiān)測等。本文紹了基于石墨烯材料的光學生物傳感器的研究進展，重點評述了基于石墨烯基的熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)以及比色法傳感器。

　　2、基于石墨烯的熒光共振能量轉(zhuǎn)移傳感器

　　熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)是能量由供體熒光團經(jīng)無輻射途徑轉(zhuǎn)移給受體熒光團，并引起供體熒光猝滅和受體熒光增強的光學現(xiàn)象，是測量活體及體外納米尺度距離及變化的有效手段。近年來，人們致力于開發(fā)基于石墨烯材料的FRET傳感器，將其用于生物及化學檢測。FRET傳感器主要由3部分構(gòu)成:供體、受體(猝滅劑)及供受體之間的橋聯(lián)媒介。在基于石墨烯的FRET傳感器中，石墨烯及其衍生物既可以作為供體，又可作為受體。一方面，石墨烯由于其結(jié)構(gòu)特點，能夠同時猝滅發(fā)射波長或結(jié)構(gòu)不同的多種熒光團的熒光，是一種通用的猝滅劑;另一方面，石墨烯及其衍生物經(jīng)過一定的化學處理，可以產(chǎn)生熒光信號，可作為熒光供體�；�于石墨烯的FRET生物傳感器依托于一些生物分子構(gòu)建的橋聯(lián)基，用于調(diào)節(jié)供體熒光團和受體之間的距離，從而引起熒光的變化。其中，DNA、蛋白質(zhì)、多肽等生物分子均可以作為橋聯(lián)基。

　　2.1、以石墨烯作為猝滅劑

　　在報道的基于石墨烯材料的FRET傳感器中，以石墨烯材料作為猝滅劑的居多。氧化石墨烯(GO)是石墨烯的一種重要衍生物，是化學還原法制備石墨烯的前驅(qū)體，在石墨烯片層結(jié)構(gòu)的邊緣和表面帶有多種含氧基團，如羧基、羥基、環(huán)氧基等。正是由于這些含氧基團的存在，使其較石墨烯具有更好的水溶性，可以應用于生物體系中。石墨烯及GO由于其大面積的共軛結(jié)構(gòu)，可以作為能量受體猝滅多種有機染料及量子點的熒光，是一種廣適性的熒光猝滅劑。與傳統(tǒng)的猝滅劑相比，石墨烯材料具有更高的猝滅效率，使FRET傳感器具有背景低、信噪比高、可多重檢測的顯著特點。

　　2.1.1、基于DNA聯(lián)接研究表明，石墨烯能區(qū)分多種DNA分子結(jié)構(gòu)，包括ssDNA，dsDNA以及莖環(huán)結(jié)構(gòu)等。石墨烯及GO由于其結(jié)構(gòu)特點，對帶有裸露的環(huán)狀結(jié)構(gòu)的化合物具有強烈的吸附能力。

　　DNA中的堿基包含六元環(huán)結(jié)構(gòu)，石墨烯會與裸露的堿基發(fā)生強烈的π-π相互作用、疏水作用等，從而吸附DNA。但是石墨烯與不同分子結(jié)構(gòu)的DNA的結(jié)合能力明顯不同。對于相同堿基數(shù)量的單鏈DNA(ssDNA)和雙鏈DNA(dsDNA)，石墨烯能夠穩(wěn)定吸附ssDNA，而對dsDNA的吸附能力則較弱。其原因是由于DNA雜交后空間結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，磷酸鹽骨架將堿基有效屏蔽在其中，使石墨烯無法與堿基接觸，從而造成結(jié)合能力的減弱。DNA一級結(jié)構(gòu)的差異也會導致與石墨烯的結(jié)合能力不同，堿基數(shù)量越多的ssDNA與石墨烯材料的結(jié)合能力越強。正是基于石墨烯對不同結(jié)構(gòu)的DNA的吸附能力有所區(qū)別，研究者們構(gòu)建了一系列以DNA聯(lián)接的石墨烯基FRET傳感器。

　　(1)利用DNA互補序列2009年，Lu等首次報道了基于石墨烯的FRET生物傳感器。該傳感器是由標記了羧基熒光素(FAM)的ssDNA與GO構(gòu)成。在沒有目標DNA時，F(xiàn)AM-ssDNA會吸附到GO表面，造成FAM與GO之間發(fā)生FRET，使FAM熒光團的熒光被迅速猝滅;而當FAM-ssDNA與目標DNA雜交后，會改變DNA的構(gòu)型并且削弱了FAM-ssDNA與GO之間的相互作用，這就造成FAMssDNA從GO表面釋放出來，增大FAM與GO之間的距離，阻礙FRET，造成FAM熒光恢復。從而建立了一種用于檢測特定DNA序列的高靈敏度及選擇性的熒光恢檢測方法。該課題組還運用GO作為納米猝滅劑構(gòu)建了一種分子信標(MB)探針。傳統(tǒng)的分子信標探針兩端分別標記熒光團和猝滅團。而這種新型的分子信標探針則只需在一端標記熒光團，而猝滅劑GO則不需要標記。與傳統(tǒng)的分子信標相比，該探針不需要復雜的合成步驟，同時猝滅更有效、靈敏度更高。更重要的是，由于發(fā)卡狀的DNA在GO表面的構(gòu)象約束大大提高了該探針對單堿基錯配的選擇性識別能力。其后相繼出現(xiàn)了以量子點(QDs)或Ag納米簇[20]標記的ssDNA探針作為信號報告基團，以GO作為猝滅劑，以類似的模型構(gòu)建FRET傳感器，用于特定DNA序列的檢測。GO能夠同時猝滅標記ssDNA探針的不同顏色的熒光，可利用此性質(zhì)識別多種與ssDNA探針互補的特定DNA序列，實現(xiàn)在同一溶液中檢測多種特定DNA序列。Zhang等構(gòu)建了免標記的石墨烯FRET傳感器，用于DNA特定序列的檢測。當體系中不存在目標ssDNA時，探針ssDNA及所用的DNA嵌插染料(SYBRGreenI，SG)都吸附在石墨烯表面;當引入目標ssDNA時，由于形成dsDNA，并且SG與dsDNA內(nèi)嵌結(jié)合，從而遠離石墨烯表面，使熒光恢復。

　　(2)利用DNA錯配DNA在通常情況下遵循堿基互配的原則，即腺嘌呤-胸腺嘧啶(A-T)、鳥嘌呤-胞嘧啶(G-C)配對。但是在某些離子存在情況下，會有錯配發(fā)生，較為常見的有C-Ag+-C和T-Hg2+-T錯配。將DNA錯配與石墨烯FRET傳感器結(jié)合，可以實現(xiàn)特定離子的檢測。Wen等利用熒光標記的富含C的ssDNA構(gòu)建了Ag+的熒光傳感器。Ag+的引入可以引起富含C的ssDNA構(gòu)型的變化，當體系中沒有Ag+時，DNA為柔軟的單鏈結(jié)構(gòu);當有Ag+存在時，C與Ag+發(fā)生絡(luò)合形成C-Ag+-C，DNA鏈形成剛性的發(fā)卡dsDNA結(jié)構(gòu)。DNA結(jié)構(gòu)的改變使DNA與GO的相互作用發(fā)生改變，從而引起體系熒光改變。Liu等也構(gòu)建了類似的平臺，利用半胱氨酸(Cys)與C-C錯競爭結(jié)合Ag+，實現(xiàn)對Cys的檢測。他們首先用足量的Ag+使富含C的ssDNA發(fā)生折疊，形成dsDNA結(jié)構(gòu)，使體系具有熒光。Cys的加入會奪取C-Ag+-C中的Ag+，使dsDNA結(jié)構(gòu)恢復成ssDNA結(jié)構(gòu)，吸附在GO表面，造成熒光猝滅，其熒光猝滅的程度與Cys的濃度成正比。Zhang等則選用一條標記了熒光且富含T的ssDNA，利用THg2+-T錯配，使ssDNA折疊成dsDNA結(jié)構(gòu)，所以Hg2+的加入會使最初較低的熒光信號增強。而碘化物比T-T錯配具有更高的與Hg2+結(jié)合的能力，碘化物的加入會造成熒光信號的再次猝滅。從而利用GO作為信號變化器，以Hg2+和碘化物作為激活劑構(gòu)建了一個簡單可靠的熒光DNA邏輯門。

　　(3)利用核酸適配體核酸適配體是一種功能性核酸，它是一段篩選出來的ssDNA序列，能夠特異性結(jié)合蛋白質(zhì)、小分子或者離子，可作為便利的傳感元件使用。核酸適配體與其特異性目標物結(jié)合會使其構(gòu)型發(fā)生改變，單鏈結(jié)構(gòu)發(fā)生折疊，阻礙核酸序列中堿基與石墨烯接觸，引起二者距離的改變。例如，選用熒光標記的凝血酶核酸適配體構(gòu)建FRET傳感器用于凝血酶的檢測。首先，熒光標記的凝血酶核酸適配體與石墨烯以非共價鍵結(jié)合，發(fā)生能量轉(zhuǎn)移，造成體系熒光猝滅;然后向體系中加入凝血酶，該核酸適配體會特異性結(jié)合凝血酶，形成四鏈體-凝血酶結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)與石墨烯的作用力較弱，最終造成體系熒光恢復。這種石墨烯-核酸適配體傳感器無論是在緩沖溶液還是血清中均表現(xiàn)出優(yōu)異的靈敏度和選擇性。文獻中報道了多種基于石墨烯的核酸適配體FRET傳感器，分別用于赭曲霉素A、三磷酸腺苷(ATP)以及粘蛋白(MUC1)等物質(zhì)的檢測。由于核酸適配體能夠選擇性識別目標物質(zhì)，區(qū)別其它結(jié)構(gòu)類似物，所以核酸適配體傳感器都具有較好的選擇性，可用于檢測稀釋的實際樣品中的待測物，如稀釋的血清、細胞提取液、紅酒等。文獻中也報道了無標記的核酸適配體傳感器。吖啶橙(AO)由于其結(jié)構(gòu)特點能夠吸附在還原的GO(rGO)表面，造成AO熒光猝滅。而G-四鏈體結(jié)構(gòu)的核酸適配體(PS.M)能夠捕獲吖啶橙，使AO從rGO表面脫離，恢復熒光。但是向AO-PS.M/GO混合液中加入血紅素時，PS.M就會與血紅素發(fā)生特異性結(jié)合，釋放出AO，AO再次與GO結(jié)合導致熒光猝滅。該方法實現(xiàn)了血紅素無標記定量檢測，檢出限為50nmol/L。

　　(4)利用脫氧核酶(DNAzyme)DNAzyme也是一種功能性核酸，具有催化功能以及識別目標分子的能力。DNAzyme可以與其對應的基底形成DNAzyme-基底雜化體，在特定離子的共同作用下，DNAzyme發(fā)揮其催化活性，將基底從斷裂位點上剪切開。Zhao等報道了一種基于GO-DNAzyme的Turn-on傳感器，用于Pb2+的熒光放大檢測。該傳感器中以FAM標記的GR-5DNAzyme-基底雜化體作為分子識別模塊及信號指示器，以GO作為猝滅劑。GR-5DNAzyme表現(xiàn)出更高的信噪比及更好的選擇性。與之相反，Wen等則利用8-17DNAzyme構(gòu)建了一種Pb2+的Turn-off熒光傳感器。同樣，采用Cu2+依賴的標記FAM的DNAzyme與石墨烯自組裝就可以構(gòu)建用于檢測Cu2+的DNAzyme傳感器。文獻中也報道了無標記的DNAzyme石墨烯傳感器模型。Liu等利用嵌插染料GelRed標記Cu2+依賴的DNAzyme的雙鏈或三鏈區(qū)域。GelRed起初只有微弱的熒光，當插入DNAzyme的雙鏈或三鏈區(qū)域會發(fā)出強烈的熒光。當引入石墨烯后，DNAzyme會與GO自組裝形成GelRed-DNAzyme-石墨烯復合物，造成熒光猝滅。由于該DNAzyme的催化活性依賴Cu2+，所以當體系中有Cu2+存在時，該DNAzyme會發(fā)生斷裂，釋放出GelRed，導致熒光信號增強。該方法可用于多種待測物的分析。

　　(5)利用核酸水解酶在核酸水解酶(核酸外切酶或核酸內(nèi)切酶)的作用下發(fā)生的酶切反應會使原有的DNA分子鏈斷裂，從而改變其分子構(gòu)型。例如，脫氧核糖核酸酶I(DNaseI)是一種核酸內(nèi)切酶，它能夠非特異性將DNA剪切成寡核苷酸;但是DNaseI只作用于ssDNA、dsDNA以及DNA/RNA復合物中的DNA鏈，卻不能作用于RNA。以DNaseI與GO保護的ssDNA探針構(gòu)成的FRET體系可以用于microRNAs(miRNA)的信號放大檢測。其原理是當沒有miRNA時，熒光標記的ssDNA探針會吸附在GO上造成熒光猝滅;在加入miRNA后，ssDNA會從GO表面脫附并與miRNA形成復合物，同時熒光恢復。此時，RNA/DNA復合物立即成為DNaseI的消化基底，由DNaseI剪切其中的DNA鏈，從而釋放出

　　miRNA，釋放出的miRNA會與另外的ssDNA探針結(jié)合，進入下一輪的剪切循環(huán)。該循環(huán)一直持續(xù)到消耗完所有的探針，所有熒光恢復，達到熒光信號顯著放大的作用。這樣利用多色熒光標記的ssDNA探針就可同時檢測多種不同的miRNA。Lin等以GO和λ核酸外切酶酶切反應為基礎(chǔ)建立了一種簡單、精確測定多核苷酸激酶(PNK)活性的方法。首先，熒光標記的dsDNA與GO混合時，體系具有熒光。但是當dsDNA被PNK磷酸化后，λ核酸外切酶會立即從末端剪切dsDNA，剪切后的片段就會吸附在GO表面，造成熒光猝滅;反之，如果體系中沒有PNK或者PNK活性被抑制，則不會發(fā)生剪切反應，體系熒光仍保持。Lee等則利用只剪切dsDNA而不剪切ssDNA的核酸外切酶Ⅲ(ExoⅢ)作用于5'端標記熒光的發(fā)卡型DNA。ExoⅢ從3'端剪切dsDNA直至dsDNA盡，只剩ssDNA，從而造成有熒光標記的一段ssDNA序列吸附在GO表面，引起體系熒光猝滅，從熒光猝滅的程度可以衡量核酸外切酶的活性。

　　(6)其它方法Wu等[39]利用解鏈溫度的差異，設(shè)計了一種用于分析DNA磷酸化反應的石墨烯分子信標，該分子信標可以測量T4多核苷酸激酶(PNK)的活性，對單堿基差異具有高特異性識別能力。該實驗中用到了兩條寡核苷酸(A，B)以及一個發(fā)卡序列DNA。其中A，B能夠組成與發(fā)卡DNA完全匹配的序列，但是A具有5'-羥基端、B兩端都為羥基端。當有PNK存在時，A和B兩條DNA鏈會發(fā)生連結(jié)，與發(fā)卡DNA構(gòu)成穩(wěn)定的雙鏈結(jié)構(gòu)，該雙鏈結(jié)構(gòu)具有較高的解鏈溫度，在50℃時體系具有較強熒光。但沒有PNK存在時，A和B兩條DNA與發(fā)卡DNA發(fā)生雜交，形成有可連結(jié)缺口的雙鏈結(jié)構(gòu)，導致該雙鏈DNA的解鏈溫度較低，在50℃時解鏈形成游離的發(fā)卡DNA的熒光會被GO猝滅，基于此原理就可以檢測T4PNK的活性。Wu等[40]則利用了DNA的三級結(jié)構(gòu)變化，構(gòu)建FRET傳感器，用于檢測猴病毒(SV40)中同型嘌呤同型啶dsDNA結(jié)構(gòu)。這段具有17個堿基對的dsDNA結(jié)構(gòu)很容易與熒光標記的ssDNA結(jié)合形成三螺旋DNA，使ssDNA從GO表面脫離，造成體系熒光恢復。Li等[41]利用博來霉素和Fe2+共同作用使ssDNA斷裂，造成較短的ssDNA鏈段從GO表面的釋放，使體系熒光增強。該方法能夠特異性檢測博來霉素的含量。

　　上文介紹了一系列以DNA結(jié)構(gòu)單一改變?yōu)榛�礎(chǔ)的石墨烯FRET傳感器。Zhang等充分利用DNA不同的構(gòu)型變化，在同一溶液中建立了一種多元檢測方法。該體系中含有多種熒光標記的DNA探針，包括特定序列的ssDNA、核酸適配體、富含胞嘧啶(C)和富含胸腺嘧啶(T)的ssDNA，每種探針以不同顏色的熒光團標記。利用石墨烯超強的猝滅效率，實現(xiàn)了同一溶液中對多種目標物的同時檢測。